Vækstkoblet enzymteknik gennem manipulation af regeneration af redoxkofaktorer

Et stadigt bredere udvalg af kemikalier produceres nu fra vedvarende råmaterialer gennem bioteknologiske metoder. Bioprocesser er stærkt afhængige af enzymatisk katalyse for effektiv produktion af disse forbindelser. At sikre, at enzymer fungerer optimalt i deres nødvendige miljø, er derfor af stor interesse for bæredygtig produktion.

Egenskaber som substratspecificitet, katalytisk hastighed og (termo)stabilitet er blandt flere kritiske faktorer, der skal optimeres for effektive enzymdrevne bioprocesser. Denne optimering kan være tidskrævende, dyr og udfordrende, og derfor er det effektive og omkostningseffektive måder, der sandsynligvis er vækstkoblet udvælgelse; ingeniørenzymer med ønskværdige egenskaber er meget eftertragtede.

Fordelene ved at bruge vækstkoblet selektion som en form for enzymselektion, hvor man forbinder enzymets aktivitet med cellens vækst. Denne metode kan bruges som en højkapacitets-selektionsstrategi og kan opnås ved enten at sikre, at væksten afhænger af produktsyntese fra målenzymet, eller ved at koble enzymets aktivitet til cellens globale energitilstand. Syntetisk biologi kan bruges til at konstruere stammer, der er egnede til vækstkoblet selektion, og nylige fremskridt har fokuseret på at konstruere stammer, der mangler oxiderede eller reducerede tilstande af redox-kofaktorpar, som kan fungere som enzymingeniørplatforme. Brugen af disse platforme kan fremskynde udviklingen af forbedrede biokatalysatorer og bioprocesser.

Fordele ved vækstkobling via kofaktor-auxotrofi

Fordelene ved at bruge kofaktor-auxotrofi som en udvælgelsesmetode til at manipulere enzymer, der er involveret i biosyntesen af visse kemikalier, såsom lipider, biobrændstoffer, gasser, organiske opløsningsmidler eller polymere forbindelser. Denne tilgang tilbyder flere unikke fordele, herunder muligheden for at vælge det ønskede produkt uafhængigt af det ønskede substrat eller produkt, hvilket gør det lettere at opdage forbedret enzymatisk aktivitet og giver en aflæsning til at påvise forbedret enzymatisk aktivitet. Derudover er brugen af kofaktor-auxotrofer som vækstkoblingsplatforme gavnlig, fordi den allestedsnærværende karakter af redox-kofaktorer i mikrobiel metabolisme betyder, at ingeniørstrategier kan overføres lateralt til andre mikrober af interesse, og enzymer kan direkte konstrueres inden for miljøet hos den ønskede mikrobielle vært. (vist som figur 1)

Figur 1: Sammenligning af flere udbredt screenings-/udvælgelsesteknikker til enzymteknik

Mutanter med mangel på NADH-oxidation

Oxidation af NADH i E. coli kan ske gennem to veje, afhængigt af ilttilgængeligheden. Under aerobe forhold oxideres NADH hovedsageligt gennem respiration for at danne ATP, mens det under anaerobe forhold kan oxideres gennem fermenteringsveje for at producere laktat og ethanol. Mutante stammer af E. coli, som ikke kan bruge blandede fermenteringsveje til NADH-oxidation under anaerob vækst, er blevet brugt til at drive NADH-oxidationsveje til anaerob syntese af forskellige kemikalier, såsom 2-methylpropan-1-ol, 2,3-butanediol, 1-butanol og L-alanin. Disse mutante stammer er også blevet brugt til at konstruere enzymer ved at udnytte lignende redoxprincipper, hvilket har resulteret i forbedrede varianter. De resulterende stammer kan bruges til at konstruere andre NAD(P)H-afhængige enzymer og veje.

Mutanter med mangel på NAD+-reduktion  

Wenk et al. skabte en E. coli-stamme ved at slette dihydrolipoyldehydrogenase (LPD)-genet, hvilket resulterede i, at stammen ikke kunne generere reducerende energi (NADH og NADPH) fra acetatmetabolismen på grund af fraværet af pyruvatdehydrogenaseaktivitet. Dette fik stammen til at udvise auxotrofi for at reducere effekten, når den blev dyrket aerobt på acetat som eneste kulstofkilde. (vist som figur 2) Stammen kunne vokse på acetat, når den blev suppleret med øvre glykolytiske substrater eller når den udtrykte NAD+-afhængige formate-, ethanol- eller methanoldehydrogenaser med deres respektive substrater. Stammen blev ikke brugt til enzymteknik og blev kun vurderet for redoxkofaktor-auxotrofi.
 

Figur 2: Centralmetabolisme 

Mutanter uden NADPH-oxidation

Der findes to forskellige strategier til at inducere NADP+ auxotrofi i E. coli, hvor man bygger på at konstruere den glykolytiske vej til at overproducere NADPH. Den første strategi indebærer at slette det native gapA-gen og udtrykke et heterologt NADP+-afhængigt GAPDH-enzym, mens den anden strategi indebærer at omdirigere kulstoffluxen gennem pentosefosfatvejen. De resulterende stammer kan ikke vokse på glukose, men viser vækst under forskellige forhold, hvor den første stamme dyrkes under anaerobe forhold og den anden under aerobe forhold med glycerol som substrat. Disse stammer bruges til at konstruere enzymer med forbedrede egenskaber, herunder substratspecificitet, katalytisk aktivitet og termostabilitet.

Mutanter med mangel på NADP+-reduktion

Tre forskellige bakterier, E. coli, P. putida og C. glutamicum, er blevet konstrueret til at være NADPH-auxotrofe, hvilket betyder, at de kræver exogent NADPH for vækst. I tilfældet med E. coli og C. glutamicum blev centrale metaboliske enzymer fjernet for at undgå NADP+-reduktion, når glukose blev leveret som kulstofkilde, mens CRISPR/nCas9-assisteret ingeniørarbejde i P. putida blev brugt til at forstyrre sæt af målgener sekventielt for at forstå deres involvering i redoxmetabolismen. NADPH-auxotrofe stammer blev derefter brugt til vækstkoblet enzymudvikling baseret på kofaktorspecificitet. En enkelt runde mutagenese med E. coli gav den mest effektive og specifikke NADP+-afhængige formiadehydrogenase til dato, mens P. putida og C. glutamicum repræsenterer de første stammer af deres art, der kan bruges til denne type ingeniørkunst.

Mutanter med mangel på NMN+-reduktion

Et vækstkoblet selektionssystem blev udviklet for at forbinde kofaktorcykling og vækst baseret på en mangel i NMN+-reduktion. E. coli SHuffle-stammen blev brugt, som bærer deletioner i to gener, der er involveret i produktionen af reduceret glutathion. En NMNH-afhængig glutathionreduktase blev udviklet gennem rationel mutagenese for at forbinde processen med NMN+/NMNH-cyklus, og en NMN+-afhængig glukosedehydrogenase blev brugt til at understøtte NMN+/NMNH-kofaktorcykling og dermed vækst. Studiet anvendte også ikke-kanonisk redoxkofaktor-auxotrofi til vækstkoblet enzymteknik for første gang, hvilket resulterede i en termostabil fosfitdehydrogenasevariant med forbedret katalytisk effektivitet og tidsmæssig stabilitet in vitro. Arbejdet giver en nyttig stamme til vækstkoblet enzymudvikling, afhængig af NMN+/NMNH-cykling og auxotrof for den reducerede tilstand af en ikke-kanonisk redox-kofaktor.

Potentialet i vækst-kobling via redox-kofaktorer fungerede som et stærkt værktøj til at udvikle biokatalysatorer, især i sammenhæng med bæredygtig bioproduktion. Selvom der er gjort betydelige fremskridt i genereringen af redoxkofaktor-auxotrofe stammer, antyder udtalelsen, at der stadig er flere uudforskede forskningsmuligheder. En af disse involverer at konstruere kofaktor-auxotrofe stammer af organismer andre end E. coli, hvilket kan åbne nye muligheder for vækstkoblet enzym-ingeniørkunst.

Overordnet set antyder det, at brugen af redox-kofaktorbaseret vækst-kobling repræsenterer en stor mulighed for ingeniørbiokatalyse, især for produktion af produkter, der ikke kan opfylde kravene fra andre højkapacitets enzymingeniørmetoder. Den understreger behovet for at udvikle mere alsidige og effektive biokatalysatorer for bæredygtig bioproduktion og understreger vigtigheden af fortsat forskning på dette område.


Reference: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Vækstkoblet enzymteknik gennem manipulation af regeneration af redoxkofaktor, Biotechnology Advances, 2023.