Optimering af reaktionsbetingelser for at opnå et højt udbytte af stevia rebaudioside D
Sukkerrige diæter har ført til en stigende forekomst af forskellige kroniske sygdomme, herunder fedme, diabetes, hjerte-kar-sygdomme og forhøjet blodtryk, hvilket udgør en betydelig global folkesundhedsudfordring. Stevia Rebaudioside D (Reb D), et naturligt sødemiddel udvundet af planter, har fået betydelig opmærksomhed som sukkererstatning på grund af sit kalorieindhold, intense sødme og behagelige smagsprofil.
Dog har dens begrænsede tilstedeværelse i stevia rebaudiana Bertoni og udfordringer relateret til lav opløselighed og enzymatisk aktivitet af plantebaseret glykosyltransferase hæmmet dens udbredte kommercielle anvendelse. Som svar på disse problemer blev en ny glykosyltransferase kaldet YojK, som stammer fra Bacillus subtilis 168, opdaget. Dette studie introducerer en genetisk modificeret bakteriel glykosyltransferase, YojK-I241T/G327N, kendetegnet ved høj opløselighed og katalytisk effektivitet, hvilket giver stort potentiale for industriel produktion af Reb D.
Udviklingen af en yderst effektiv metode til produktion af rebaudiosid D ved brug af en kaskadereaktion af YojK-I241T/G327N og AtSuSy-enzymer.
For at løse problemet med lav opløselighed i plantebaserede glykosyltransferaser undersøgte forskere potentialet ved at bruge YojK, en O-glykosyltransferase fra Bacillus subtilis 168. YojK blev valgt på grund af dets dokumenterede glykosyleringsaktivitet med forskellige substrater, herunder store molekyler. Efter vellykket rekombinant ekspression og rensning blev YojK anvendt til at glykosylere Reb A, hvilket resulterede i produktionen af Stevia Reb D. Enzymkinetisk analyse viste, at YojK har lavere katalytisk aktivitet mod Reb D sammenlignet med andre glykosyltransferaser. Derfor antyder undersøgelsen nødvendigheden af strukturstyret ingeniørarbejde for at forbedre YojKs katalytiske aktivitet til potentielle praktiske anvendelser. (som vist i figur 1)
Figur 1
Optimering af reaktionsbetingelser for at opnå et højt udbytte af rebaudiosid D.
Reaktionsbetingelserne, herunder pH, temperatur og substratkoncentration, kan optimeres for at opnå et højt udbytte af Srevia Reb D. Studiet brugte molekylær dynamik-simuleringer til at undersøge, hvordan YojK-I241T/G327N-varianten forbedrer Reb D-glykosyleringen. Varianten opretholdt en stabil hydrogenbinding mellem Reb A og H14 under simuleringerne, i modsætning til wild-typen (som vist i Figur 2). Denne stabilitet strakte sig også til afstanden mellem Reb A's O2-atom og UDPG's C1P. YojK-I241T/G327N-variantens forbedrede katalytiske effektivitet blev tilskrevet disse stabile interaktioner, hvilket antyder dens praktiske potentiale.
Figur 2
Figur 3
Konklusion
Denne tilgang gav 83,47 % Reb D. Bemærkelsesværdigt var det, at tilføjelsen af 1 mM UDPG muliggjorde syntesen af 20,59 g/L Reb D med et bemærkelsesværdigt udbytte på 91,29 %, hvilket overgik tidligere studier. Denne proces demonstrerer potentialet for industriel produktion af Reb D, især efter YojKs strukturelle ingeniørarbejde.YojK kan effektivt udtrykkes i E. coli BL21 (DE3) med høj opløselighed. Gennem strukturstyret ingeniørarbejde blev en dobbelt mutant, YojK-I241T/G327N, skabt, hvilket muliggjorde storskalaproduktion af Reb D med et enestående udbytte på 91,29 % ved at genanvende UDPG katalyseret af sukrosesyntase AtSuSy. Denne undersøgelse præsenterer YojK-I241T/G327N som et lovende værktøj til økonomisk effektiv industriel produktion af Reb D.
