Kvantificering af NAD+ og dets metabolitter i musens iskiasnerver
Introduktion
De afgørende dele af nicotinamidadenindinukleotid (NAD+) og dets metabolitter i aldring og neurodegeneration er bredt anerkendt. For at fremme fremskridt mod biokemisk forskning og interventioner rettet mod aldring og neurodegenerative sygdomme er det af stor betydning at kvantificere NAD+ og dets metabolitters niveauer i NAD+-redningsvejen nøjagtigt. Her anvendes en robust og præcis LC-MS/MS-metode til at kvantificere NAD+ og dets metabolitters niveauer i normal og skadet mus iskiasnerv.Begrænsninger ved eksisterende metoder til kvantificering af NAD+ og dets metabolitter
Traditionelle metoder til kvantificering af NAD+ og dets metabolitter, såsom HPLC-UV, NMR, kapillærzoneelektroforese eller kolorimetriske enzymatiske assays, står over for forskellige udfordringer med hensyn til følsomhed, selektivitet og indirekte måling. Hvad angår eksisterende LC-MS/MS-assays til måling af cellulært eller vævs-NAD+ og dets metabolitter, er der stadig mange vanskeligheder at overvinde, såsom forlængede køretider, dårlig kromatografisk retention og utilfredsstillende peakformer. Desuden kan kun en til tre stoffer i NAD+-redningsvejen dækkes af disse metoder.Ændringerne af LC-MS/MS-metoden
På baggrund af eksisterende LC-MS/MS-assays foretages ændringer vedrørende de kromatografiske betingelser, surrogatmatrix og MS/MS-betingelser. Specifikt anvendes 5 μM methylenfosfonsyre som mobilfaseadditiv, hvilket eksplicit fremmer signalintensiteten og peakformen. På grund af den relativt rene og enkle karakter af nerveprøver og deres lille størrelse testes ultraprent vand som en erstatningsmatrix. I stedet for hydrofil interaktionsvæskekromatografisøjle og hypercarb-søjle anvendes Waters Atlantis Premier BEH C18 AX-søjlen, hvis unikke MaxPeak HPS højtydende overfladeteknologi (passivering af søjlens indervæg, eliminering af metaloverflade) muliggør høj reproducerbarhed, peaksymmetri og basislinjeseparation af alle analytter.Derudover optimeres MS-betingelserne for at minimere NAD+-interferenssignalet i kanalen for cyklisk adenosindiphosphatribose (cADPR), mens responsen af cADPR og nicotinamidmononukleotid (NMN) opretholdes, med 4000V for ionspray-spænding, 450℃ for turboheater-temperatur, 50 psi for Gas 1, 50 psi for Gas 2, 30 psi for curtain gas og 12 psi for kollisionsgas.
Repræsentativt kromatogram af nerveprøver (normal vs skadet)
Alle fem analytter opnår basislinjeseparation, hvor cADPR er en følsom biomarkør i neurodegenerationsmodellen. Her inducerer iskiasnervaksotomi aksonal degeneration, hvilket fører til reduceret NAD+-niveau og forhøjet NMN-niveau i de skadede nerver, hvilket resulterer i en cirka 2-fold stigning i NMN/NAD+-forholdet. Samtidig falder niveauerne af nicotinamid (NAM) og adenosindiphosphatribose (ADPR) med cirka 2-fold, mens cADPR-niveauet stiger med mere end 8-fold. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere rapporteret forskning, hvilket bekræfter nøjagtigheden af denne modificerede LC-MS/MS-metode til kvantificering af NAD+ og dets metabolitter.
Konklusion
Denne modificerede LC-MS/MS-metode muliggør effektiv basislinjeseparation af NAD+, NMN, NAM, ADPR og cADPR inden for en kort køretid på 5 min, hvilket bidrager til tidlig diagnose af forskellige neurologiske lidelser og lægemiddeludvikling mod aldring og neurodegenerative sygdomme.Referencer
Ma Y, Deng L, Du Z. Udvikling og validering af en LC-MS/MS-metode til kvantificering af NAD+ og relaterede metabolitter i mus iskiasnerver og dens anvendelse på en dyremodel for nerveskade. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTAChar siden 2012 været dedikeret til forskning og udvikling, fremstilling og salg af råmaterialer til coenzymer og naturlige produkter, med egne fabrikker, over 170 globale patenter samt et stærkt F&U-team. BONTAC har rig F&U-erfaring og avanceret teknologi inden for biosyntese afNAD og dets forløbere(f.eks. NMN og NR). Der er forskellige typer NAD at vælge imellem, der omfatter NAD ER Grade (endoxin-fjernelse), NAD Grade I (IVD/kosttilskud/kosmetisk råpulver), NAD Grade II (API/mellemprodukter) og NAD Grade IV (hvis der er højere krav til opløselighed), som kan leveres i form af lyofiliseret pulver eller krystallinsk pulver. Renheden af BONTAC NAD kan nå over 98%.
