Kvantificering af NAD+ og dets metabolitter i muse-iskiasnerver
Indførelsen
De afgørende dele af nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD+) og dets metabolitter i aldring og neurodegeneration er bredt anerkendt. For at fremme fremskridt mod biokemisk forskning og interventioner rettet mod aldrings- og neurodegenerative sygdomme er det af stor betydning nøjagtigt at kvantificere NAD+ og dets metabolitniveauer i NAD+ redningsvejen. Her anvendes en robust og præcis LC-MS/MS-metode til at kvantificere NAD+ og dets metabolitniveauer i normal og skadede muse-iskiasnerve.Begrænsninger ved eksisterende metoder til kvantificering af NAD+ og dets metabolitter
Traditionelle metoder til at kvantificere NAD+ og dets metabolitter, såsom HPLC-UV, NMR, kapillærzoneelektroforese eller kolorimetriske enzymatiske analyser, står over for forskellige udfordringer inden for følsomhed, selektivitet og indirekte måling. Hvad angår eksisterende LC-MS/MS-analyser for cellulære eller vævsmålinger af NAD+ og dets metabolitter, er der stadig mange vanskeligheder, såsom forlængede driftstider, dårlig kromatografisk retentionsadfærd og utilfredsstillende topformer. Desuden kan kun én til tre stoffer i NAD+ redningsvejen dækkes af disse metoder.Ændringerne af LC-MS/MS-metoden
On the basis of existing LC-MS/MS assays, the modifications regarding the chromatographic conditions, surrogate matrix and MS/MS conditions are conducted. Specifically, 5 μM of methylene phosphonic acid is employed as the mobile phase additive, which explicitly promotes the signal intensity and peak shape. Given the relatively clean and simple nature of never samples and their small size, ultrapure water is tested as a substitute matrix. Instead of hydrophilic interaction liquid chromatography column and hypercarb column, the Waters Atlantis Premier BEH C18 AX column is utilized, whose unique MaxPeak HPS high-performance surface technology (passivating the column inner wall, eliminating metal surface) enables the high reproducibility, peak symmetry, and baseline separation of all analytes. Derudover er MS-forholdene optimeret for at minimere NAD+-interferenssignalet i den cykliske adenosindiphosphat-ribose (cADPR)-kanal, samtidig med at responsen af cADPR og nicotinamidmononukleotid (NMN) opretholdes, med 4000V for ionsprayspænding, 450°C for turbovarmetemperatur, 50 psi for gas 1, 50 psi for gas 2, 30 psi for gardingas og 12 psi for kollisionsgas.
Repræsentativt kromatogram af nerveprøver (normale vs. skadede)
Alle fem analytter opnår baseline-adskillelse, hvor cADPR er en følsom biomarkør i neurodegenerationsmodellen. Her inducerer ischiasnerveaxotomi axotomi axonal degeneration, hvilket fører til reduceret NAD+-niveau og forhøjet NMN-niveau i de skadede nerver, hvilket resulterer i en cirka 2-dobling af NMN/NAD+-forholdet. Samtidig sænkes niveauerne af nicotinamid (NAM) og adenosindiphosphatribose (ADPR) med cirka 2 gange, mens cADPR-niveauet øges med mere end 8 gange. Disse resultater stemmer overens med tidligere rapporterede undersøgelser og bekræfter nøjagtigheden af denne modificerede LS-MS/MS-metode i kvantificering af NAD+ og dets metabolitter.
Konklusion
Denne modificerede LC-MS/MS-metode muliggør effektiv baseline-adskillelse af NAD+, NMN, NAM, ADPR og cADPR inden for en kort driftstid på 5 minutter, hvilket bidrager til tidlige diagnoser af forskellige neurologiske lidelser og lægemiddeludvikling til aldrings- og neurodegenerative sygdomme.Reference
Ma Y, Deng L, Du Z. Udvikling og validering af en LC-MS/MS-metode til kvantificering af NAD+ og relaterede metabolitter i muses iskiasnerver og dens anvendelse på en dyremodel for nerveskader. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTAC har siden 2012 været dedikeret til forskning og udvikling, fremstilling og salg af råmaterialer til koenzym og naturlige produkter med selvejede fabrikker, over 170 globale patenter samt et stærkt forsknings- og udviklingsteam. BONTAC har stor erfaring inden for forskning og udvikling og avanceret teknologi inden for biosyntese af NAD og dets forløbere (f.eks. NMN og NR). Der er forskellige typer NAD, der kan vælges, herunder NAD ER Grade (endoxinfjernelse), NAD Grade I (IVD/kosttilskud/kosmetik råpulver), NAD Grade II (API/mellemprodukter) og NAD Grade IV (hvis der er højere krav til opløselighed), som kan leveres i form af lyofiliseret pulver eller krystallinsk pulver. Renheden af BONTAC NAD kan nå op til over 98%.
